SOCS-3在直肠癌的表达

 何成彦^1*  李洪军  王海

（吉林大学中日联谊医院，长春， 130033)

摘要：目的：探讨人直肠癌组织中细胞因子信号转导抑制因子3（SOCS-3）的表达。方法：应用RT-PCR法测定8例人正常直肠组织、16例直肠癌组织（青年组8例、老年组8例）中SOCS-3的表达。结果：与正常直肠组织相比较，青年组、老年组病人直肠癌组织SOCS-3 mRNA的表达均呈降低趋势，老年组更为显著（p<0.01）；老年组直肠癌组织SOCS-3mRNA 表达水平显著低于青年组（p<0.05）。结论：SOCS-3基因在老年人直肠癌的发生、发展中可能起着更为重要的作用。

关键词：直肠癌；细胞因子信号转导抑制因子－3（SOCS-3）

Expression of SOCS-3 in rectal cancers

He Cheng-yan^1*

Abstract: Objective To investigate the expression level of suppressor of cytokine signaling-3 in the human rectal cancers. Methods: （1）The expression level of SOCS-3 in rectal cancers was detected by RT-PCR, including eight human normal rectal specimens , sixteen human rectal cancer  specimens ( eight ones come from younger patients, eight ones come from older patients).；（2）Results: Compared to the normal control, the expression level of SOCS-3 in rectal cancer specimens    was lower, and the younger patient group was more significant （p<0.01）.Conclude:  This results indicate the expression of suppressor of cytokine signaling 3 have been more significantly changed during the development and progress of rectal cancer in elders. 

Key words: rectal cancer ; SOCS-3

近来研究表明细胞因子信号转导抑制因子(suppressor of cytokine signaling, SOCS)家族成员之一SOCS－3通过抑制JAK/STAT信号传导通路发挥生物学作用^（1，2）。JAK/STAT信号传导通路与肿瘤的发生、发展密切相关^（3，4）。SOCS家族在肺癌、乳腺癌等常见恶性肿瘤疾病进程中的作用已引起人们的关注^（5，6），但尚未见有关SOCS-3与直肠癌关系的报道。本文探讨了SOCS－3在青年及老年病人直肠癌组织的表达，为进一步探讨SOCS-3在直肠癌的发生、发展中的作用奠定实验基础。

1材料和方法

1.1 组织标本 

8例人正常直肠组织、16例直肠癌组织，取自吉林大学中日联谊医院2004年10月-2005年10月活检及手术切除标本，取材后置于无菌塑料盒，速冻于液氮中备用。所有标本均经病理证实，直肠癌组织包括腺癌10例、粘液癌4例、未分化癌2例。直肠癌病人青年组8例，年龄为28～45岁、老年组8例，年龄为60～70岁。

1.2 主要试剂 

Trizol（Invitrogen），RT-PCR试剂盒（北京鼎国），丙烯酰胺（Promega），甲叉双。

*通讯作者：何成彦，吉林大学中日联谊医院检验科；邮编：130033；电话：0431－4995127；  chengyanhe469@vip.sina.com

丙烯酰胺(Sigma)，DNA marker(北京鼎国)，琼脂糖等

引物：SOCS-3：上游引物：5’-CAGCTCCAAGAGCGAGTAC-3；下游引物：5’-GTTCTTGGTCCCAGACT-3；GAPDH：上游引物：5’-ATCTTCCAGGAGCGAGATC-3；下游引物：5’-AGAGGCAGGGATGATGTTC-3 (上海生工合成)。

1.4总RNA提取

按Trizol试剂说明提取肿瘤组织总RNA。方法简述如下：低温下制备癌组织匀浆，加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解；按每ml Trizol 加入200μl氯仿，振荡混匀，室温放

置5min， 4℃、12000rpm离心15min后，小心吸取上层无色液体，弃下层酚相；按每ml Trizol 加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10min，4℃ 12000rpm离心10min，弃上清，RNA沉于管底；按每1ml Trizol 加入1ml 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，4℃、7500rpm 离心5min，尽量弃上清。室温晾干10min，用无菌DEPC水溶解沉淀；紫外分光光度计测定RNA含量及纯度，电泳检测RNA完整性。

1.5RT-PCR  按北京鼎国生物技术公司RT -PCR试剂盒说明合成cDNA第一链并进行PCR，方

法简述如下：RT反应：取2μg 模板RNA于0.5ml PCR管中，70℃保温5分钟，离心数秒，放置冰浴中。按试剂盒说明书配制20μl反应体系。室温放置10分钟，37°C反应30分钟。 

PCR反应：取4μl RT反应产物，按试剂盒制备反应体系，离心数秒，在PCR仪中扩增。反应条件为：94℃变性45秒，53℃复性45秒，72℃延伸45秒，30个循环后72℃延伸5分钟。

取9μl PCR反应产物加1μl上样缓冲液在1.2%琼脂糖凝胶中电泳,电泳结束后EB染色观察结果。凝胶在图像分析处理系统上计算出SOCS-3和GAPDH密度，用GAPDH密度作为内参照，求出SOCS-3基因表达的相对值。

1.6统计方法

SPSS软件进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 RNA抽提  抽提的肿瘤组织和细胞系总RNA经甲醛变性凝胶电泳结果显示所抽提RNA完整。所有标本总RNA OD₂₆₀/OD₂₈₀比值均在1.8～2.0间。

2.2 SOCS-3 mRNA 在直肠癌组织中的表达  利用RT-PCR技术和设定的引物，得到预期SOCS-3和GAPDH扩增产物。采用PCR扩增的DNA含量间接表示mRNA水平。

    结果显示：在本实验条件下，与正常直肠组织相比，青年组、老年组直肠癌组织SOCS-3

mRNA 表达水平均呈降低趋势（青年组与正常对照组相比，p<0.05；老年组与正常对照组相比，p<0.01）；老年组直肠癌组织SOCS-3mRNA 表达水平显著低于青年组，p<0.05 ，见图1、表1。

－500bp

SOCS-3—

－300bp

－200bp

－100bp

GAPDH—

1     2    3     4     5    M

 

图1. SOCS-3在直肠癌组织中的表达 （琼脂糖凝胶电泳） （1：正常直肠组织；2：直肠癌组织（青年组）；3，4：直肠癌组织（老年组）； 5：空白对照；M: Marker；）

 

表1. SOCS-3 在直肠癌组织相对表达水平比较     （M: Marker； 1: 正常胃组织；2：胃癌组织；3：胃癌细胞系SWWC）

 

* SOCS-3基因表达的相对值，以GAPDH为内参照）

3 讨论

SOCS主要作用机制是抑制JAK/STAT信号传导途径。近年来SOCS－3在恶性肿瘤中表达的研究引起关注，如在人小细胞肺癌、肝细胞癌、人乳腺癌的研究发现，高达80％病例SOCS3表达显著降低，表明恶性增殖性疾病中， SOCS系统可能处于低反应状态^（6）。

本文测定了青年及老年人直肠癌组织中SOCS-3 mRNA的表达。结果表明：人直肠癌中SOCS-3在转录水平的表达呈显著降低趋势，而且老年组更为显著。提示我们：在恶性肿瘤中SOCS-3的低反应性，对增殖性细胞传导信号的抑制能力降低，细胞的增殖更加活跃，因此SOCS-3可能为一种重要的抑癌基因，在肿瘤的发生、发展中起重要作用。另外，我们发现在老年组病人，癌组织中SOCS-3表达水平更为低下。这一结果提示我们老年病人体内某些重要肿瘤抑制因子处于低反应状态，可能为老年病人恶性肿瘤发病率较高的重要原因之一。另外，从初步研究中我们未观察到青年组或老年组内不同病理类型直肠癌SOCS-3表达的差异，若扩大各病理类型直肠癌组织的标本量，可能得到有意义的结果，到目前为止未见相关报道。

本研究为进一步深入探讨SOCS在恶性肿瘤发病机制、辅助诊断、靶向治疗中的作用奠定了实验基础。但鉴于肿瘤的发生、发展机制及其复杂，涉及众多因素，有关SOCS与肿瘤相关性尚需从多方面进行探讨。

4  参考文献

1  田志刚. JAK/STAT信号传导通路特异抑制物—SOCS系统的发现及意义[J]. 中国免疫学杂志，2000；16（1）：454-455.

2  Brnder C, Nielsen M, Kaltoft K, et al. STAT3-mediated constitutive expression of SOCS-3 in cutaneous T-cell lymphoma[J].Blood，2001；97（2）：1056-1062.

3  Lee H, Yu H. Methylation of Stat1 promoter can contribute to squamous cell carcinogenesis[J].J Natl Cancer Inst，2006；98（3）：154-5.

4  Corvinus FM, Orth C, Moriggl R, et al. Persistent STAT3 activation in colon cancer is associated with enhanced cell proliferation and tumor growth[J]. Neoplasia，2005；7（6）：545-55.

5  Biao He, Liang You et al. SOCS-3 is frequently silenced by hypermethylation and suppresses cell growth in human lung cancer[J]. Proc Natl Acad Sci U S，2003；100（24）：14133-14138.

6  Farabegoli F, Ceccarelli C, Santini D, et al. Suppressor of cytokine signalling 2 (SOCS-2) expression in breast carcinoma[J]. J Clin Pathol，2005；58（10）：1046-50.

7  Niwa Y, Kanda H, Shikauchi Y, et al. Methylation silencing of SOCS-3 promotes cell growth and migration by enhancing JAK/STAT and FAK signalings in human hepatocellular carcinoma[J]. Oncogene，2005；24（42）：6406-17.